染色凋亡試劑盒

　　細胞凋亡是指為維持有機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡。正常情況下任何細胞在形成過程中發(fā)生的異常都會通過凋亡消除。例如體內(nèi)的癌細胞增長為腫瘤的過程會受細胞凋亡的引導而被抑制。然而在抑癌基因p53出現(xiàn)問題時，凋亡就不會誘導發(fā)生，從而導致癌細胞的不斷增長。細胞凋亡可以通過細胞形態(tài)的變化或生物化學的變化來檢測。目前常用的指標有caspase活性變化、DNA碎片、磷脂酰絲氨酸的外翻等。

　　染色凋亡試劑盒是一種采用Hoechst 33342和碘化丙啶(Propidium Iodide ,PI )雙熒光染色方法進行細胞周期與細胞壞死分析的檢測試劑盒。單純的PI染色能夠觀察DNA直方圖上凋亡細胞的亞G1峰，但只能代表G0/G1期發(fā)生凋亡，無法觀察S期和G2期發(fā)生的細胞凋亡，而且細胞經(jīng)過固定后無法對活細胞和死細胞進行區(qū)分。Hoechst 33342可以穿透細胞膜，進入正常細胞和凋亡細胞與DNA結合，能在紫外線下顯示藍色熒光，而且染色后凋亡細胞熒光會比正常細胞明顯增強。PI不能穿透細胞膜，對于具有完整細胞膜的正常細胞或凋亡細胞不能染色。而對于壞死細胞，其細胞膜的完整性喪失，PI可以穿透細胞膜使壞死細胞著色產(chǎn)生紅色熒光。

　　檢測與分析：用流式細胞儀在激發(fā)波長400～500nm檢測藍色熒光，在大于630nm 處檢測紅色熒光，同時檢測光散射情況。采用適當分析軟件進行細胞DNA含量分析和光散射分析。如果使用熒光顯微鏡檢測，檢測前4℃ 1000g 離心3～5min沉淀細胞，用PBS洗滌一次，再涂片觀察紅色熒光和藍色熒光。對于貼壁細胞使用熒光顯微鏡檢測，亦可不收集細胞，棄培養(yǎng)液后直接依次按照上述比例加入試劑即可。

　　雙染后，可在流式細胞儀上將正常細胞、凋亡細胞和壞死細胞區(qū)別開來。在二元直方圖上，正常細胞對Hoechst 33342具有拒染性，呈弱藍色熒光+弱紅色熒光（Hoechst 33342+/PI+）；凋亡細胞對Hoechst 33342具有嗜染性呈強藍色熒光+弱紅色熒光（Hoechst 33342++/PI+）；壞死細胞對PI具有嗜染性，呈弱藍色熒光+強紅色熒光。本試劑盒亦可用熒光顯微鏡進行觀察，檢測細胞含量范圍一般為0.1~1×106之間。

　　染色凋亡試劑盒試驗注意事項：

　　1、熒光染料都存在淬滅的問題，建議染色后盡快檢測。

　　2、在為了獲得細胞沉淀的離心的過程中，對于特殊細胞，如果細胞沉淀不充分，可以適當提高離心力或延長離心時間。

　　3、Hoechst 33342與細胞孵育的時間不宜過長，一般控制在20 min以內(nèi)。太長容易引起Hoechst 33342的發(fā)射光譜由藍光向紅光遷移，導致紅色熒光與蘭色熒光的比例改變。