染色凋亡試劑盒的實驗方法和原理

　　染色凋亡試劑盒進(jìn)行PBS清洗時，每次清洗5min。PBS清洗后，為了各種反應(yīng)的有效進(jìn)行，請盡量除去PBS溶液后再進(jìn)行下一步反應(yīng)。在載玻片上的樣本上加上實驗用反應(yīng)液后，請蓋上蓋玻片或保鮮膜，或在濕盒中進(jìn)行，這樣可以使反應(yīng)液均勻分布于樣本整體，又可以防止反應(yīng)液干燥造成實驗失敗。

　　甲基綠（MethylGreen）染液（3-5%甲基綠溶于0.1M醋酸巴比妥PH4.0）染色后，請用滅菌蒸餾水清洗多余的甲基綠。然后進(jìn)行洗凈（100%乙醇）、脫水（二甲苯）透明、封片后通過光學(xué)顯微鏡觀察操作。如果此時使用80~90%的乙醇洗凈時，甲基綠比較容易脫色，注意快速進(jìn)行脫水操作。熒光素標(biāo)記的dUTP液含甲次鹽和二氯鈷等致癌物，可通過吸入、口服等途徑進(jìn)入機體，注意防護(hù)。

　　染色凋亡試劑盒實驗方法和原理：

　　細(xì)胞凋亡早期改變發(fā)生在細(xì)胞膜表面，目前早期識別仍有困難。這些細(xì)胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸（PS）從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外，使PS暴露在細(xì)胞膜外表面。PS是一種帶負(fù)電荷的磷脂，正常主要存在于細(xì)胞膜的內(nèi)面，在細(xì)胞發(fā)生凋亡時細(xì)胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被破壞而使PS暴露在細(xì)胞膜外。

　　AnnexinV是一種Ca+依賴的磷脂結(jié)合蛋白，發(fā)現(xiàn)是一種具有很強的抗凝血特性的血管蛋白，AnnexinV具有易于結(jié)合到磷脂類如PS的特性。對PS有高度的親和性。因此，該蛋白可充當(dāng)一敏感的探針檢測暴露在細(xì)胞膜表面的PS。

　　PS轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外不是凋亡所*的，也可發(fā)生在細(xì)胞壞死中。兩種細(xì)胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細(xì)胞膜是完好的，而細(xì)胞壞死在其早期階段細(xì)胞膜的完整性就破壞了。因此，可以建立一種用AnnexinV結(jié)合在細(xì)胞膜表面作為凋亡的指示并結(jié)合一種染料排除試驗以檢測細(xì)胞膜的完整性的檢測方法。