小鼠原代細胞分離實驗步驟

　　小鼠原代細胞是從小鼠的特定組織中提取出來的，則可直接得到目的基因不表達的原代細胞模型，且與我們在KO小鼠上的研究具有更好的承接性，從而讓我們想要證實的實驗目的更具有說服性。KO小鼠的原代細胞還可用于細胞水平的藥物篩選、藥物評價等方面。原代細胞（Primary cells）是指來源活體組織，經特定分離方法制備而成的初始細胞。原代細胞離體時間短且不經過永生化過程，其生物學特性未發生很大變化，仍保持原有的遺傳特征，可更好地反映細胞在體內的生長狀態，從而獲得與體內生理功能更接近的數據。

　　小鼠原代細胞分離實驗步驟：

　　1、小鼠麻醉

　　根據體重計算相應的麻醉劑量并腹腔注射（也可以用異氟烷進行空氣麻醉）

　　2、對*麻醉后的小鼠進行解剖，打開腹腔，找到小鼠下腔靜脈及門靜脈，使用滯留針插入下腔靜脈，將50-60ml的緩沖溶液一在10-20min內緩慢注射進入小鼠血液循環內，看到小鼠肝臟有明顯腫脹時剪開門靜脈，完成后改用緩沖溶液二進行沖洗。

　　3、沖洗完成后，將小鼠肝臟剪下，轉移至DMEM高糖培養基，用DMEM培養基清洗2-3次后，使用滅菌鑷子將肝臟在培養基內撕開，使原代肝細胞從肝臟內流出。

　　4、將分離得到的肝臟細胞過篩網篩選，過濾組織碎塊及其他雜質，并對細胞混懸液離心，按照一定的離心力得到初步的肝細胞沉淀，此時的肝細胞中混雜著肝臟實質細胞和非實質細胞，需要使用percoll離心液進行梯度離心。

　　5、梯度離心后的細胞即為原代肝臟實質細胞，重懸后計數即可用于后續的實驗，若對細胞純度存疑，也可以進行流式測定。