原代細胞的復蘇步驟

細胞一般儲存在液氮中，溫度達-196℃，理論上儲存時間是無限的。細胞凍存及復蘇的基本原則是慢凍快融，實驗證明這樣可以最大限度的保存細胞活力。

細胞復蘇就是要把原本冷凍保存(凍存)著的細胞恢復到一般的生長狀態(tài)，今天我們來看看原代細胞的復蘇步驟。

一、檢查

收到細胞株包裹時，請檢查細胞株冷凍管是否有解凍情形，若有請立即處理告訴寄方。細胞株請盡速開始培養(yǎng)，或立即冷凍保存(置于–70 °C，隔夜后，移到liq N2)。

二、冷凍細胞解凍

1、依據細胞株說明書規(guī)定的基礎培養(yǎng)基種類、血清種類和其它規(guī)定之成份和比例，制備培養(yǎng)基。

絕大多數(shù)之細胞均無法立即適應不同基礎培養(yǎng)基或不同的血清種類，若因實驗需要，必須有所不同時，務必以緩慢比例漸次改變培養(yǎng)基組成，確定細胞適應后，方進行所需之實驗。

2、 FBS (fetal bovine serum, 胎牛血清), CS (calfserum, 小牛血清)和HS (horseserum, 馬血清)，對細胞而言差異較大，請務必依據細胞株資料規(guī)定的血清種類培養(yǎng)細胞。

3、將培養(yǎng)基置于37 °C 水槽中回溫，回溫后噴以70 % 酒精并擦拭之，移入無菌操作臺內。取出冷凍管，立即放入37 °C 水槽中快速解凍，水面高度不可接近或高過冷凍管之蓋沿，否則易發(fā)生污染。輕搖冷凍管使其在1 分鐘內全部融化后，以70 % ethanol 擦拭冷凍管外部，移入無菌操作臺內。

4、依據細胞種類和濃度，于無菌操作臺內取10 ml 培養(yǎng)基加至T25 或T75 flask中。取出已解凍之細胞懸浮液，緩緩加入T25 或T75 flask 內之培養(yǎng)基，混合均勻，放入37 °C，5 % CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

5、對絕大多數(shù)細胞而言，1 % 以下之冷凍保護劑DMSO，不會對細胞之貼附或活化有不良影響，不需立刻由解凍細胞中去除，待第二天確定細胞生長或貼附良好后再去除即可。

對極少數(shù)因對DMSO 敏感或會造成細胞分化之細胞，需立即去除DMSO 者，則可將解凍后之細胞懸浮液放入5 - 10 ml 培養(yǎng)基中，離心300 xg (約1000 rpm)，5 分鐘，小心移去上清液，加入適量新鮮培養(yǎng)基，將細胞均勻混合后，轉移至培養(yǎng)瓶中，再放入37 °C， 5 % CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

三、收到T25 flask 細胞時的處理方式

1. 于寄送過程中，為避免起泡造成細胞脫落死亡，T25 flask 均加滿培養(yǎng)基。請檢查flask 外觀，并于顯微鏡下觀察細胞生長狀況和有無污染現(xiàn)象，若有任何問題，不要打開蓋子，請立即通知細胞實驗室。

2. 將原封之T25 flask 靜置于37 °C， 5 % CO2 培養(yǎng)箱中，使細胞回溫至37 °C，并讓運送過程中少數(shù)脫落的細胞可再附著生長。

隔天后，于無菌操作箱內取出flask內之培養(yǎng)基，(取出之培養(yǎng)基可以再使用)，僅留約5-10ml 培養(yǎng)基于flask 內，依一般培養(yǎng)方式再將細胞置入培養(yǎng)箱中，或細胞已長滿盤，則將細胞做傳代培養(yǎng)。

四，細胞復蘇注意事項

1、整個復蘇過程盡量手腳麻利一些，戰(zhàn)線拉得太長可能影響復蘇效果;

2、由于“化冰”這一步里凍存管與水溫差太大，尤其是液氮里來的凍存管，放到水里可能會造成翻江倒海的既視感，所以可以用鑷子夾住凍存管往水里摁，這樣即使有炸裂的情況也會有水做緩沖;

3、取凍存管時要謹防凍傷，尤其是夏天，盡管熱也盡量穿長袖白大褂，一些不經意的動作可能會把你的小鮮肉“粘”到冰箱門上;

4、離心這一步也可以在凍存管里的冰融化后直接進行，也就是直接把凍存管離心，離心后棄去原來的凍存液，然后直接加*培養(yǎng)基重懸細胞，接著把細胞轉到培養(yǎng)皿/瓶里培養(yǎng)。這種方法也許不能將DMSO清除得很干凈，但是基本影響不大。

5、 復蘇第二天記得去看看細胞，如果狀態(tài)還不錯的話就說明復蘇成功。